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          公司新聞
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          The Scientist:生命科學30年的進步(基因編輯、干細胞、DNA測序
          2016-10-11 10:19   查看  
          導讀
          2016年10月,The Scientist雜志迎來30周年慶典,并針對生命科學領域30年以來的發展歷程出版了特別專題。特刊圍繞“DNA測序”、“顯微鏡”、“神經科學”、“基因編輯”和“干細胞”5大領域的研究突破和技術更新分別展開論述,以呈現這些精準、高效的方法和工具對解密生命所做出的貢獻和創新。

          十月初,《The Scientist》雜志為紀念創刊30周年,推出30年生命科學領域主流技術發展的回顧特刊。專題針對“DNA測序”、“顯微鏡”、“神經科學”、“基因編輯”和“干細胞”5大領域相關研究突破和技術變革展開論述,并以時間軸的形式呈現出科學發展的精彩和魅力。

          生物探索小編對其中內容進行了編譯,整理如下:

          DNA測序

          基因測序技術直接推動著生命醫學的發展,并改變著我們對物種多樣性、疾病機理和防治策略等多領域的認知和理解。過去,DNA測序技術成本高昂、繁瑣費時。如今,它已經進入了快速低廉、且擁有標準體系的高通量時代,先后經歷了3次變革(Sanger鏈終止法、高通量測序、單分子測序)。

          上世紀70年代,DNA測序技術的研究開始綻放火花。初期,華裔分子生物學家吳瑞先生開創性設計出“引物延伸”的測序策略。1977年,劍橋大學生物化學家Frederick Sanger及其團隊在引物延伸策略的基礎之上,在PNAS發表文章,利用DNA聚合酶的雙脫氧鏈終止原理創建了DNA測序主流技術——Sanger法(雙脫氧鏈終止法)。

          同年,美國哈佛大學物理學家與生物化學家Walter Gilbert與 Alan Maxam合作共同基于Sanger直讀法原理,利用特異的化學試劑修飾不同堿基,獨立提出另一種測序方法——化學裂解法。

          傳統的化學降解法、Sanger法以及在它們基礎之上發展來的各種測序技術統稱為第一代DNA測序技術。1986年美國應用生物系統公司ABI(Applied Biosystems Inc.成立于1981年)基于第一代測序技術推出世界首個自動化DNA熒光測序儀。1990年人類基因組計劃(HGP)啟動,并耗時10年完成人類基因組草圖的繪制。

          人類基因組計劃的完成讓我們進入功能基因組時代,無疑提高了對DNA測序技術的深度、速度和重復性等方面的高需求,從而推動了第二代測序技術的發展。2005年,454生命科學公司利用焦磷酸測序原理推出首個第二代測序平臺,能夠以99%的準確率完成2500萬堿基序列的讀取工作。

          隨后,以羅氏的GS FLX測序平臺、Illumina的Solexa Genome Analyzer測序平臺和ABI的SOLiD測序平臺為代表的第二代測序技術先后在市場上嶄露頭角,它們的顯著特點包括大規模平行測序、低成本,并因此得到廣泛應用,例如分子診斷行業。

          現在,以單分子測序為特征的第三代測序技術已經出現,典型的包括Helicos公司的Heliscope單分子測序儀、Pacific Biosciences公司的SMRT技術、Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的納米孔單分子技術。這一最新技術旨在克服錯誤率問題,使得測序不再需要PCR擴增環節,延續了高通量測序的優點并實現了更為快速、低廉的單分子測序。

          基因測序是實現個性化醫療和精準醫學的關鍵技術。未來,它還將面臨著更大的發展和應用空間。

          1977: Sanger—NIH, Gilbert—National Library of Medicine; 1996: TS Staff; 2005: Courtesy of Roche; 2006: Biochemical Society Transactions Feb 01, 2015,43(1)1-5; DOI: 10.1042/BST20140254; 2014: Courtesy of Illumina

          干細胞

           

          關于干細胞的研究可追溯至上世紀90年代。

          1981年,科學家從小鼠胚胎中分離出多能干細胞,這一類特殊的細胞能夠自我更新、復制出更多的細胞用于研究,同時還可以作為構架轉基因小鼠的原材料。多倫多兒童醫院的發育生物學家Janet Rossant表示:“老鼠胚胎干細胞改變了整個哺乳動物遺傳學的研究。”

          17年后,科學家能夠將小鼠胚胎干細胞(ESCs)誘導分化成多種細胞類型,例如造血細胞、肌肉細胞和神經細胞。同時,他們開始將目光轉向人類細胞。1998年,威斯康星-麥迪遜大學的發育生物學家James Thomson帶領團隊成功從捐贈的人類體外受精胚胎中分離出干細胞,同年約翰霍普金斯大學的John Gearhart團隊也在捐贈的胎兒組織中成功獲取胚胎干細胞。

          1996年,有著克隆之父之稱的胚胎學家Ian Wilmut團隊成功培育出第一只克隆羊多莉。多莉的出生運用的是無性生殖技術,通過將乳腺細胞的細胞核移入已經去核的卵細胞中,使其融合形成胚胎細胞,并最終成功克隆出來小綿羊。這意味著,高度分化的成熟細胞也具有全能性的潛力。隨后的細胞融合試驗表明,人類胚胎干細胞也存在重編程因子,使其具有分化成多種細胞類型的能力。

          但是,以胚胎為原材料展開的干細胞研究涉及倫理問題。那么,是否可以對體細胞重編程使其重返多能性呢?2006年,山中伸彌(Shinya Yamanaka)實驗室成功利用病毒載體將4個轉錄因子轉入成年老鼠的皮膚細胞中,使其重編程并獲得一簇類似于胚胎干細胞(ESCs)的新型細胞,由此打開了誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的研究大門。

          2007年,包括山中伸彌在內的三個研究團隊再次重復該試驗并改進了重編程方法。同時,山中伸彌和威斯康星大學麥迪遜分校James Thomson合作,成功將人類成體細胞誘導成多能性干細胞,并因此入選Science年度十大科學突破。截止2009年,圍繞誘導性多能干細胞的學術文章多達300篇。

          誘導性多能干細胞與胚胎干細胞的類似程度有多少?已有研究證實,誘導性多功能干細胞依然保留著原成熟細胞的表觀遺傳學記憶。但是,專家認為這種差異不會影響細胞治療的效果。

          全球多個實驗室正在多能性細胞生成應用于臨床治療的多種細胞,例如胰腺β細胞(糖尿病)、多巴胺神經細胞(帕金森癥)。2010年,美國Geron公司獲FDA批準首次開啟基于人類胚胎干細胞治療脊椎損傷的臨床試驗。遺憾的是,2011年,因為高額成本問題該項目被終止。

          2014年,日本理化學研究所(RIKEN)干細胞臨床研究員Masayo Takahashi團隊完成首例誘導性多能干細胞治療黃斑變性的臨床試驗,并取得成功。在第二例臨床試驗開戰之前,出于安全等顧慮這一臨床項目被暫停。但是,2016年6月,RIKEN研究所發布公告將重新啟動基于異體iPS細胞治療黃斑變性的臨床試驗。

          基于干細胞的自我更新復制、具有多向分化的獨特功能,其在轉化醫學、再生醫學、精準醫學的應用越來越受到重視。

          1981: iStock.com/tiripero; 1998: Julie Baker lab, Stanford University School of Medicine, via CIRM; 2001: White House photo by Eric Draper; 2007: Kathrin Plath lab, University of California, Los Angeles, via CIRM; 2009: iStock.com/halduns; 2010: BruceBlaus/Wikimedia Commons; 2014: CSIRO/Wikimedia Commons

          基因編輯

          談及基因編輯的發展需要從基因敲除說起。

          19世紀80年代中期,威斯康星大學麥迪遜分校Oliver Smithies、猶他大學的Mario Capecchi分別成功利用同源重組原理改變小鼠細胞基因組中特定區域,為基因敲除技術的發展奠定基礎。屆時,英國卡迪夫大學的Martin Evans開發出培育小鼠胚胎干細胞的方法,為驗證基因打靶技術提供了細胞模型。1987年,Capecchi和Smithies團隊利用同源重組和目標載體成功編輯小鼠胚胎干細胞的基因。

          隨著PCR和基因測序技術的發展,對小鼠基因組的讀取越來越便捷,但是同源重組是利用載體將外源基因導入受體細胞染色體上,通過交換達到編輯基因的目的,其編輯效率極低。

          1991年,約翰霍普金斯大學的Nikola Pavletich和Carl Pabo團隊發現了鋅指重復結構,每個鋅指結構能夠識別3個堿基。1994年,紐約斯隆凱特林研究所的發育生物學家Maria Jasin團隊篩選到一種核酸內切酶,能夠增加同源重組的概率。2001年,研究人員成功將改造的鋅指蛋白和核酸酶結合,從而靶向切除非洲爪蟾蜍細胞特定的DNA片段。

          以上研究奠定了鋅指核酸酶(Zinc-finger nuclease, ZFN)技術的發展。ZFN由鋅指DNA結合域和限制性內切酶的DNA切割域融合而成。ZFN技術的原理是通過人為改造鋅指DNA結合域,靶向定位于不同的DNA序列,從而使得ZFN可以結合復雜基因組中的目的序列,并由DNA切割域進行特異性切割。

          杜克大學的分子生物學家Charles Gersbach團隊開發出轉錄激活樣效應因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)系統。與鋅指蛋白類似,TAL效應因子(TALE)同樣具有特異性結合能力,將其與FokI核酸酶結合,即構成具有特異性基因編輯功能的武器——TALEN。TALEN技術曾被科學雜志列入十大科技突破行列(2012年)。

          通過誘導DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break)來刺激容易出錯的非同源末端連接或在特定基因所在的位置進行的同源定向修復,TALEN和ZFN能夠完成一系列遺傳學編輯修飾操作。

          基因編輯領域的發展快速遠超我們的想象,尤其是CRISPR/Cas技術。作為最新成形的基因編輯工具,CRISPR技術能夠完成RNA導向的DNA識別及編輯,為構建更高效的基因定點修飾技術提供了全新的平臺。2012年,Pubmed錄入相關文獻僅為126篇,2016年圍繞CRISPR發表的最新研究數量已經增長了10倍。

          當然,每一種技術都有其局限性,這也是科學家始終在尋找更為優化的基因編輯工具的根源。這些技術如何造福人類,還需要投入很多工作和時間。

          1987: Emw/Wikimedia Commons; 1990: iStock.com/sidsnapper; 1991: NCBI; 2010: David Goodsell/Wikimedia Commons; 2012: molekuul_be/Shutterstock.com; 2014: Thomas Splettstoesser/Wikimedia Commons

          神經科學

          紐約大學神經科學研究所的神經科學家György Buzsáki早在上世紀80年代就試圖進入小鼠大腦。當時尚在加州大學圣地亞哥分校工作的他通過乙醚、低溫麻醉小鼠,利用顱骨鉆孔將鍍金不銹鋼電極植入小鼠大腦。借助這些電極小板,他可以監測到小鼠運動、認知、記憶過程中,其大腦單個神經元的電壓變化。

          當時最多只能放置16個電極設備,而現在,科學家們可以借助硅電極芯片同時測量1000個神經元的變化。利用探針測量大腦電生理學變化或者腦電圖(EGG)測試依然是神經成像實驗室的主流技術。

          神經科學領域另一個發展了幾十年的傳統方法是膜片鉗技術(patch clamping),發展自上世紀70年代末期。膜片鉗技術利用離子通道的電流反映細胞膜單一或多個離子通道的分子活動。然而,膜片鉗技術是侵入性的,且因為會干擾細胞正常功能而不能長時間使用。

          所以,科學家一直在尋找優化的方法。隨著傳感器和顯微技術的發展,功能鈣成像技術越來越受到歡迎,其原理是通過熒光染料信號的改變反映細胞內游離鈣離子濃度,以此代表細胞的功能狀態。

          1977年,科學家首次將磁共振成像(MRI)運用于人身上,可以無創性的獲取大腦結構圖。磁共振成像利用外磁場和物體的相互作用實現成像,對大腦無反射性危害。但是直至功能性磁共振成像(fMRI)的出現,才真正推進了MRI在神經影像學領域的廣泛應用。fMRI利用磁振造影來測量神經元活動所引發之血液動力的改變。

          除了成像,操控大腦也是科學家們試圖解析大腦工作機理的另一途徑。2005年,利用光線操控神經元的技術出現,由此打開了光遺傳學的應用前景。MIT的Edward Boyden和斯坦福大學的Karl Deisseroth及其同事將響應光離子的通道植入哺乳動物神經細胞。利用光遺傳學技術,科學家們可以改變或者換刺激小鼠大腦內的特定神經元,從而關閉癲癇發作、抑制激進行為。2007年,除了光學,科學家們試圖利用化學物質實現控制的目的,他們利用G蛋白偶聯受體的存在,通過注入合成的特異配體刺激或者沉默神經元。

          需要清醒的是,即便科學家們現在已經找到同時記錄神經元活動以及操控嚙齒動物大腦細胞的技術,但是人類大腦依然是一個謎。

          1924: Andrii Cherninskyi/Wikimedia Commons; 1976: N. Fertig/Wikimedia Commons; 1980’s: Radiology, Uppsala University Hospital; 2001: Akerboom, Rivera, Guilbe, Malavé, Hernandez, Tian, Hires, Marvin, Looger, Schreiter ER/Wikimedia Commons; 2005: MIT MCGOVERN INSTITUTE, JULIE PRYOR, CHARLES JENNINGS, SPUTNIK ANIMATION, ED BOYDEN; 2007: Jeff W. Lichtman and Joshua R. Sanes/Wikimedia Commons; 2015: Ed Boyden, Fei Chen, Paul Tillberg/MIT

          顯微鏡

          顯微鏡是由一個透鏡或幾個透鏡的組合構成的一種光學儀器,是人類進入原子時代的標志。從共焦熒光顯微鏡到超分辨率、實時三維成像,該領域也經歷著日新月異的變革。

          第一臺顯微鏡誕生于17世紀荷蘭,其透鏡分辨率達到1微米,由A•V•Leeuwenhoek(列文虎克)打造。1873年,物理學家Ernst Karl Abbe提出顯微鏡的分辨率受限于光的衍射,且傳統的光學顯微鏡分辨率有一個物理極限,即所用光波波長的一半(0.2微米)。同時,他與Carl Zeiss、Otto Schott合作研發出分辨率達到0.2微米的顯微鏡。

          然而,隨后的發展卻打破了這一預言。2000年,Stefan Hell試圖突破分辨極限,成功發明出受激發射損耗熒光成像技術(STED),能夠高分辨率掃描整個樣品。2004年,Eric Betzig基于光激活原理(William Moerner發現),研發出光激活定位顯微鏡(PALM)。

          分辨率的問題得到解決之后,科學家開始思考另一個問題:如何避免對樣本的損害。Betzig為此對STED進行了改造,降低光水平。此外,結構光學顯微鏡(SIM)通過較為“溫和”的光激活實現成像。2004年,歐洲生物學實驗室(EMBL)的物理學家Ernst Stelzer團隊研發出選擇性平面照明顯微鏡(SPIM),它能夠在亞細胞水平對活體樣本實現多角度觀察。得益于這些技術的更新,生物學家們能夠看到和探索不一樣的細微世界。

          2014年, Betzig、Moerner和Hell 3位科學家共同獲得諾貝爾化學獎,以表彰他們在超分辨率熒光顯微鏡領域做出的貢獻。


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